En enkelt .ico-fil kan indeholde flere forskellige ikoner i forskellige opløsninger, op til 256x256 (Vista-format). Windows vil vælge den opløsning den mener er bedst til den størrelse den skal bruge, og foretager så evt. skalering ved siden af.
Find dig en ikon-editor der kan klare det nye 256x256 PNG format i ikoner. Jeg ved selvfølgelig ikke hvilken du vil synes bedst om, men et eksempel er IcoFX:
http://icofx.ro/Der er også en ikoneditor indbygget i Visual Studio/Visual C#, men den er ikke specielt avanceret.
http://en.wikipedia.org/wiki/.ico har bl.a. en liste over hvilke ikonstørrelser du bør have med i din .ico-fil. 32x32 og 48x48 kan typisk laves blot ved at skalere 256x256'eren ned og måske rette lidt til - 16x16 er mere tilbøjelig til at skulle ændres en del mere, for at sikre at det kan genkendes. De forskellige farvedybder vil nok også kræve en vis tilretning, men det afhænger af dit ikon.
Naturligvis kan du også lave dit ikon som et andet format, og så finde et program der kan konvertere - det giver ikke et lige så godt resultat som hvis du laver det hele drekte i .ICO-format, men det kan være godt nok til dit formål.